E. coli host cell proteins （HCP） constitute a diverse and functionally intricate group of macromolecules within the Escherichia coli cell. The host proteins of E. coli play crucial roles in various cellular processes. These proteins are involved in fundamental metabolic pathways such as glycolysis, the tricarboxylic acid cycle, and amino acid biosynthesis, which are essential for the survival and growth of the bacterium. Recombinant expression in E. coli is a simple and cost-effective method for producing certain proteins. These proteins, often used as therapeutic agents, must be highly purified. The manufacturing process may introduce contamination by HCPs from E. coli, which can reduce efficacy and cause adverse reactions. Therefore, minimizing HCP impurities is crucial. This simple, sensitive, and fast OneStep ELISA is a powerful method for optimizing purification processes, process control, routine quality control, and product release testing.
 

一步法ELISA試劑盒使用過程如下：  

試劑與樣本準備  

將所有試劑（標準品、檢測抗體、底物、終止液等）和待測樣本恢復至室溫（20-25℃），確保標準品和樣本做復孔以增加可靠性。  

樣本處理：  

血清/血漿：3000rpm離心10分鐘，取上清；避免溶血。  

細胞培養(yǎng)上清：1000rpm離心5分鐘，取上清。  

組織勻漿：按1:9重量體積比加入PBS（含蛋白酶抑制劑），冰上研磨后5000×g離心5-10分鐘，取上清。  

加樣與孵育  

從鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條密封放回4℃。  

設(shè)置標準品孔、樣本孔和空白孔：  

標準品孔：加入不同濃度標準品50μL。  

樣本孔：加入待測樣本50μL（或先加10μL樣本+40μL稀釋液）。  

空白孔：不加任何液體。  

除空白孔外，所有孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃恒溫箱或水浴鍋避光孵育60分鐘。  

洗滌  

棄去液體，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置20秒后甩去，吸水紙上拍干，重復洗滌5次（可用洗板機設(shè)置浸泡30秒程序提高精度）。  

顯色與終止  

每孔加入底物A和B各50μL（或按1:1混合后加100μL），37℃避光孵育15分鐘。  

每孔加入終止液50μL，輕輕晃動混勻，溶液顏色由藍色變?yōu)辄S色。  

結(jié)果測定  

在15分鐘內(nèi)使用酶標儀于450nm波長處測定各孔吸光度（OD值）。  

以標準品濃度為橫坐標、OD值為縱坐標繪制標準曲線，通過回歸方程計算樣本濃度（若樣本稀釋，需乘以稀釋倍數(shù)）。  

一步法ELISA試劑盒關(guān)鍵的注意事項：  

溫度控制：所有試劑和樣本需平衡至室溫，孵育溫度嚴格控制在37℃。  

避免交叉污染：加樣時使用干凈槍頭，洗板時防止液體濺出。  

鉤狀效應(yīng)：高濃度樣本需稀釋后重測，避免因抗原過剩導致假陰性。  

試劑保存：未用完的板條密封放回4℃，試劑盒避光保存于2-8℃。