The green fluorescent protein （GFP） is a protein that exhibit bright green fluorescence when exposed to blue light. It is a widely used reporter in gene expression and protein localization studies. the green fluorescent protein （GFP） from the jellyfish Aequorea victoria is a widely used reporter in studies of gene expression and protein localization. GFP is a single chain polypeptide of 238 amino acids .Most of these amino acids form β sheets that are compacted through an antiparallel structure to form the barrel. So far, they have been used as reporters of gene expression, tracers of cell lineage, and as fusion tags to monitor protein localization within living cells.
 

GFP重組的步驟遵循基因工程的基本框架，具體可分為以下6步：  

1.目的基因與GFP基因的獲取  

目的基因：通過(guò)PCR擴(kuò)增從生物體基因組中獲取，或從基因文庫(kù)中篩選。  

GFP基因：可直接使用野生型GFP基因，或經(jīng)過(guò)優(yōu)化的突變體（如增強(qiáng)型EGFP，熒光強(qiáng)度更高、更穩(wěn)定）。  

2.載體的選擇與制備  

載體是攜帶基因進(jìn)入宿主細(xì)胞的“工具”，常用的有質(zhì)粒（適用于細(xì)菌、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞）、病毒載體（如腺病毒，適用于動(dòng)物活體）等。  

載體需經(jīng)過(guò)酶切處理，使其兩端產(chǎn)生與目的基因、GFP基因匹配的粘性末端，便于后續(xù)連接。  

3.基因連接：構(gòu)建融合基因表達(dá)載體  

使用DNA連接酶，將目的基因、GFP基因按照一定順序（通常是目的基因在前，GFP在后，或反之，需根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)）連接到載體中，形成“目的基因-GFP融合基因表達(dá)載體”。  

關(guān)鍵：確保融合基因的閱讀框（ORF）正確，否則會(huì)導(dǎo)致蛋白合成異常，失去熒光活性。  

4.轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染：將重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞  

轉(zhuǎn)化：針對(duì)細(xì)菌、酵母等微生物，通過(guò)化學(xué)處理（如氯化鈣法）或電穿孔法讓細(xì)胞吸收載體。  

轉(zhuǎn)染：針對(duì)動(dòng)物細(xì)胞，常用脂質(zhì)體介導(dǎo)、病毒介導(dǎo)或顯微注射等方法。  

5.篩選與鑒定：獲得陽(yáng)性克隆  

載體通常攜帶篩選標(biāo)記（如抗生素抗性基因），通過(guò)抗性篩選可初步獲得成功導(dǎo)入載體的細(xì)胞。  

進(jìn)一步通過(guò)PCR、測(cè)序等方法驗(yàn)證融合基因是否正確插入，確保重組載體構(gòu)建無(wú)誤。  

6.表達(dá)與熒光檢測(cè)  

誘導(dǎo)宿主細(xì)胞表達(dá)融合蛋白（如通過(guò)IPTG誘導(dǎo)細(xì)菌表達(dá)，或利用載體自帶的啟動(dòng)子在特定條件下啟動(dòng)表達(dá)）。  

使用熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀等設(shè)備，在藍(lán)光激發(fā)下觀察綠色熒光，驗(yàn)證融合蛋白是否成功表達(dá)及定位。  

GFP重組的優(yōu)勢(shì)與注意事項(xiàng)  

優(yōu)勢(shì)：  

非侵入性：無(wú)需破壞細(xì)胞或組織，可活體、實(shí)時(shí)觀察。  

高特異性：僅標(biāo)記目標(biāo)分子，信號(hào)干擾少。  

操作靈活：可與多種基因、載體結(jié)合，適配原核到真核的多種宿主。  

注意事項(xiàng)：  

可能影響目的蛋白功能：GFP分子量約27kD，若與小分子蛋白融合，可能改變其空間結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致功能異常（需通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證）。  

熒光淬滅：長(zhǎng)時(shí)間激發(fā)可能導(dǎo)致GFP熒光減弱，需控制觀測(cè)時(shí)間或使用抗淬滅試劑。  

啟動(dòng)子選擇：需根據(jù)宿主細(xì)胞類型選擇合適的啟動(dòng)子（如原核生物用lac啟動(dòng)子，哺乳動(dòng)物細(xì)胞用CMV啟動(dòng)子），確保GFP正常表達(dá)。