Glutathione S-transferases are a family of eukaryotic and prokaryotic phase II metabolic isozymes best known for their ability to catalyze the conjugation of the reduced form of glutathione to xenobiotic substrates for the purpose of detoxification. The GST family consists of three super-families: the cytosolic, mitochondrial, and microsomal （also known as MAPEG proteins）. Based on their biochemical, immunologic and structural properties, the soluble GSTs are categorized into 4 main classes: alpha, mu, pi, and theta.
 

GST標(biāo)簽蛋白純化主要基于谷胱甘肽與GST標(biāo)簽的特異性結(jié)合，通過親和層析實現(xiàn)目標(biāo)蛋白的分離，以下是詳細的純化步驟及關(guān)鍵注意事項：

一、核心純化步驟

菌體培養(yǎng)與誘導(dǎo)表達

將含有GST標(biāo)簽蛋白表達載體的大腸桿菌接種至LB培養(yǎng)基（含氨芐青霉素），37℃振蕩培養(yǎng)至OD600≈0.5-0.8。

加入IPTG（終濃度1 mmol/L）誘導(dǎo)表達5小時，充分表達。

菌體收集與裂解

離心收集菌體：4℃下8000 rpm離心15分鐘，棄上清。

洗滌菌體：用PBS（pH 7.2）洗滌菌體沉淀，去除殘留培養(yǎng)基。

裂解菌體：

反復(fù)凍融法：將菌體沉淀反復(fù)凍融3-4次，破壞細胞膜。

超聲波破碎：用PBS（pH 8.0）重懸菌體，冰浴中超聲波破碎至溶液不再粘稠（功率200-300 W，超聲3秒，間隔6秒，總時長5-10分鐘）。

離心分離上清：4℃下8000 rpm離心10分鐘，收集上清液。

親和層析純化

平衡層析柱：用5倍柱體積的PBS（pH 6.5-8.0）平衡谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂柱。

上樣結(jié)合：將裂解上清液緩慢加入層析柱，室溫輕搖結(jié)合30分鐘（或4℃旋轉(zhuǎn)孵育2-4小時）。

洗滌去雜：用10倍柱體積的PBS洗滌層析柱，去除未結(jié)合的雜蛋白。

洗脫目標(biāo)蛋白：

谷胱甘肽洗脫法：加入1倍柱體積的谷胱甘肽洗脫緩沖液（50 mM Tris-HCl + 10-60 mM還原型谷胱甘肽，pH 8.0-9.0），室溫輕搖10分鐘，重復(fù)2-3次，合并洗脫液。

優(yōu)化條件：在洗脫緩沖液中加入1-5 mM DTT防止二硫鍵形成，或增加NaCl濃度（0.1-0.5 M）減少非特異性吸附。

蛋白濃度測定與保存

濃度測定：用紫外分光光度計測定洗脫液在260 nm和280 nm的吸光度，計算蛋白質(zhì)濃度（公式：蛋白質(zhì)濃度(mg/mL)=(1.45×A280-0.74×A260)×稀釋倍數(shù)）。

保存條件：純化后的可置于-20℃保存，或直接用于后續(xù)實驗。

二、關(guān)鍵注意事項

裂解方式優(yōu)化

避免過度裂解導(dǎo)致GST標(biāo)簽蛋白變性（如超聲波功率過高或時間過長）。

若蛋白表達為包涵體，需用尿素或鹽酸胍變性溶解，再通過復(fù)性緩沖液逐步稀釋復(fù)性。

緩沖液條件控制

pH范圍：谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂在pH 6.5-8.0時結(jié)合效率高，偏離此范圍會導(dǎo)致結(jié)合能力下降。

還原劑使用：在裂解緩沖液和洗脫緩沖液中加入1-10 mM DTT，防止氧化聚集。

鹽濃度調(diào)整：高鹽濃度（0.5 M NaCl）可減少非特異性吸附，但需根據(jù)蛋白特性優(yōu)化。

上樣與洗脫流速

低流速上樣：控制流速為0.2-1 ml/min（1 ml柱子）或1-5 ml/min（5 ml柱子），避免流速過快導(dǎo)致結(jié)合不充分。

溫和洗脫：洗脫時流速為1-2 ml/min（1 ml柱子）或5-10 ml/min（5 ml柱子），確保目標(biāo)蛋白洗脫。

GST標(biāo)簽切除（可選）

若需去除GST標(biāo)簽，可在洗脫后加入特異性蛋白酶（如PreScission Protease、Thrombin或Factor Xa）進行酶切。

柱上酶切：在層析柱上直接加入蛋白酶，洗脫后獲得無標(biāo)簽的目標(biāo)蛋白（純度更高）。

柱下酶切：洗脫后加入蛋白酶，需通過后續(xù)純化步驟（如離子交換層析）分離標(biāo)簽和目標(biāo)蛋白。